Kit ta' Immunopreċipitazzjoni (Żibeġ Manjetiċi tal-Proteina A/G)

IP jew Co-IP hija teknika sperimentali komuni għall-istudju tal-proteini jew interazzjonijiet proteina-proteina (PPIs) billi jintużaw antikorpi speċifiċi u mezz li jorbot l-antikorpi (eż. Protein A/G Agarose jew Protein A/G żibeġ manjetiċi), jew bl-użu dirett mezz akkoppjat ma’ antikorpi speċifiċi (eż. ġellijiet ta’ agarose jew żibeġ manjetiċi), u mbagħad iżolati l-kumplessi antiġen-antikorp mill-kampjuni kkumplikati ta’ proteini permezz ta’ ċentrifugazzjoni jew manjetiċi forza, li sussegwentement tista 'tintuża għal Western blot jew spettrometrija tal-massa. Proteina G hija proteina li torbot immunoglobulina espressa minnBatterji streptokokkalitip C jew G. Proteina A hija proteina tal-wiċċ tal-ħajt taċ-ċelluli misjuba fiStaphylococcus aureusb'piż molekulari ta' 42kDa. Proteina A u Proteina G huma funzjonalment simili u jistgħu jorbtu speċifikament ma 'immunoglobulina tal-mammiferi (Ig). Proteina A u G rikombinanti b'modifiki xierqa marbuta ma 'żibeġ manjetiċi jistgħu jintużaw għal immunopreċipitazzjoni jew purifikazzjoni ta' antikorpi. Żibeġ manjetiċi tal-proteina A huma adattati għall-immunopreċipitazzjoni tal-bniedem IgG1, IgG2, IgG4, ġurdien IgG2a, IgG2b, filwaqt li żibeġ manjetiċi tal-proteina G huma adattati għall-immunopreċipitazzjoni tal-bniedem IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ġurdien IgG2a, IGG2b1, IGG2b, IGG2 , far Antikorpi poliklonali IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c. (Ara Tabella I għal informazzjoni speċifika)

Dan il-prodott jadotta l-żibeġ manjetiċi ttikkettjati bil-proteina A/G żviluppati u prodotti minnu nnifsu, meta mqabbla ma 'prodotti simili fis-suq, dan il-prodott jorbot l-antikorpi b'mod aktar effiċjenti u għandu rata ta' rbit mhux speċifika aktar baxxa, flimkien mal-buffer ottimizzat, huwa jista 'jkun konvenjenti u effiċjenti għal esperimenti ta' immunopreċipitazzjoni; jista 'jintuża b'mod wiesa' fl-iżolament u l-purifikazzjoni tal-proteini fil-mira f'kampjuni bħal lisati taċ-ċelluli, supernatanti ta 'sekrezzjoni ċellulari, serum, axxite, eċċ.; Dan il-kit jipprovdi żewġ metodi ta 'elużjoni (elużjoni ta' denaturazzjoni u eluzzjoni ta 'aċidu) biex elużjoni tal-proteina fil-mira, speċjalment l-elużjoni ta' l-aċidu mhux se jkun fiha l-ktajjen ħfief u tqal ta 'l-antikorp, li jistgħu jsolvu b'mod effettiv il-problema ta' l-interferenza ta 'l-antikorp tqil u ħafif. ktajjen fl-esperimenti ta 'immunopreċipitazzjoni u immunoblotting tal-proteini.

Vapur bis-silġ imxarrab; 5X SDS-PAGE loading buffer (imnaqqas) għandu jinħażen fi grad -20 u ieħor fi grad 2-8 għal 12-il xahar.

1. Preparazzjoni tal-kit

a) Irreferi għat-tabella hawn taħt, ipprepara r-reaġenti rilevanti fi proporzjon ta' 100-500 μL ta' lisat għal kull kampjun;

b) Preparazzjoni ta' IP lysate li fih inibitur tal-protease: Irreferi għat-tabella ta 'hawn fuq, uża {{0}} μL ta' IP lysate li fih inibitur tal-protease għal kull 0.5-1 miljun ċellula għal liżi; ħallat l-IP lysate ma '50x Cocktail protease inhibitor (G2006-250UL huwa rakkomandat) fi proporzjon ta' 50:1, Per eżempju, żid 20 μL ta '50x Cocktail protease inhibitor f'1 mL ta' IP lysate, imbagħad 1 mL ta ' IP lysate li fih inibitur tal-protease se jinkiseb; il-lysate IP ippreparat li fih l-inibitur għandu jitqiegħed f'banju tas-silġ jew f'4 gradi.

c) Nota: Jekk il-proteina fil-mira tal-immunopreċipitazzjoni tinvolvi modifika tal-fosforilazzjoni jew tal-aċetilazzjoni, għandu jiżdied l-inibitur tal-fosfatażi jew l-inibitur tad-deacetylase (provdut minnu nnifsu); Inibitur li fih IP lysate għandu jiġi ppreparat qabel l-użu, u m'għandux jiġi ffriżat u miżmum għal użu sussegwenti.

d) Preparazzjoni ta '1×TBS: Iddilwa 10×TBS buffer b'ilma ultra-pur għal 1×TBS. Per eżempju, Żid 1 mL ta '10 × TBS buffer ma' 9 mL ta 'ilma ultra-pur, li huwa 1 × TBS buffer wara ħawwad sew.

e) Preparazzjoni ta '1x SDS-PAGE loading buffer (mnaqqsa): ammont xieraq ta' 5x SDS-PAGE loading buffer (imnaqqas) ġie dilwit 5 darbiet b'ilma ultra-pur biex jagħmel 1x SDS-PAGE loading buffer (imnaqqas); pereżempju, ħallat 0.2mL ta' buffer ta' proteina 5x (imnaqqas) ma' 0.8 mL ilma ultra-pur, li huwa buffer ta' tagħbija 1x SDS-PAGE (imnaqqas).

2. Preparazzjoni tal-kampjun tal-antiġen

L-esperimenti ta 'immunopreċipitazzjoni jew immunopreċipitazzjoni għandhom jitwettqu immedjatament wara lissed kampjuni, jekk le, il-kampjuni jistgħu jinħażnu fil-friġġ fi -20 grad jew -80 grad, iżda l-iffriżar u t-tidwib jistgħu jaffettwaw l-interazzjonijiet proteina-proteina; il-passi kollha tal-liżi tal-kampjun għandhom jitħaddmu f'banju tas-silġ jew f'4 gradi sabiex tiġi minimizzata d-degradazzjoni tal-proteina, u ċertu ammont tal-kampjun għandu jittieħed bħala Input jew Total wara li l-kampjun ikun ġie ppreparat għal skoperta sussegwenti minn Western Blot.

Għal kampjuni tat-tessuti:

a) It-tessuti għandhom jitlaħlaħ f'PBS qabel kiesaħ biex jitneħħa d-demm żejjed sewwa. Iżen u kapuljat f'biċċiet żgħar f'omoġenizzatur fuq is-silġ.

b) Żid l-IP lysate li fih inibitur tal-protease fi proporzjon ta’ 100-200 μL għal kull 10-20 mg ta’ tessut, jew naqqas l-ammont ta’ IP lysate jekk ikunu meħtieġa konċentrazzjonijiet ogħla ta’ proteina.

c) Omoġenizza b'omoġenizzatur tal-ħġieġ jew omoġenizzatur li jinżamm fl-idejn, jew uża l-grinder tagħna b'temperatura baxxa KZ-III-F żviluppata minnha nfisha għal tħin sħiħ.

d) L-omoġenat ġie trasferit għal tubu ċentrifugu ta '1.5 mL, imħawwad u mħallat, u għajm fis-silġ għal 30 min, irrepeti minfuħa b'pipetta kull 10 min biex tiżgura liżi kompleta taċ-ċelloli tat-tessuti.

e) Iċċentrifuga fi 12,000 xg għal 5 minuti f'4 gradi, armi l-preċipitat u aspira s-supernatant għal esperimenti sussegwenti ta' immunopreċipitazzjoni jew immunopreċipitazzjoni.

Għal kampjuni ta' ċelluli aderenti:

a) Jekk meħtieġ, iċ-ċelloli jistgħu jinħaslu 2-3 darbiet bil-PBS, jassorbi l-likwidu residwu sewwa fl-aħħar darba.

b) Obrox iċ-ċelloli bi barraxa taċ-ċelluli jew trypsin iddiġerixxi ċ-ċelloli biex tagħmilhom sospiżi għal kollox, iġborhom f'tubu ċentrifugu ta' 1.5 mL u ċentrifuga f'1,000 xg għal 5 min f'4 gradi, armi s-supernatant għal iġbor il-preċipitat taċ-ċellula.

c) Żid {{0}} μL ta' IP lysate li fih inibitur tal-protease għal kull 0.5-1 miljun ċellula (ekwivalenti għal bir wieħed ta' pjanċa ta' 6-bir); daqqa b'mod xieraq u banju tas-silġ għal 3-5 min biex iċ-ċelluli jiġu lisati kompletament, u m'għandux ikun hemm preċipitazzjoni ċellulari ovvja wara lissati kompletament; jekk l-ammont ta' ċelluli huwa akbar, huwa rakkomandat li ċ-ċelluli jinqasmu f'0.5-1 miljun ċellula/tubu għal liżi sħiħa.

d) Iċċentrifuga fi 12,000 xg għal 5 minuti f'4 gradi, armi l-preċipitat u aspira s-supernatant għal esperimenti sussegwenti ta' immunopreċipitazzjoni jew immunopreċipitazzjoni.

Għas-sospensjoni tal-kampjuni taċ-ċelluli:

a) Iċċentrifuga f'1000 g għal 5 min f'4 gradi biex tiġbor il-preċipitat; jekk meħtieġ, aħsel darba bil-PBS, imbagħad aspira l-likwidu residwu u bil-mod vortex biex tferrex iċ-ċelloli kemm jista 'jkun.

b) Żid {{0}} μL ta' IP lysate li jkun fih inibitur tal-protease għal kull 0.5-1 miljun ċellula (ekwivalenti għal bir wieħed ta' 6-pjanċa tal-bir); daqqa b'mod xieraq u banju tas-silġ għal 3-5 min biex iċ-ċelluli jiġu lisati kompletament; jekk l-ammont ta' ċelluli huwa akbar, huwa rakkomandat li ċ-ċelluli jinqasmu f'0.5-1 miljun ċellula/tubu għal liżi sħiħa.

c) Iċċentrifuga fi 12,000 xg għal 5 minuti f'4 gradi, armi l-preċipitat u aspira s-supernatant għal esperimenti sussegwenti ta' immunopreċipitazzjoni jew immunopreċipitazzjoni.

Għal kampjuni ta' batterji jew ħmira:

a) Ħu 1 mL ta’ soluzzjoni batterjali jew ta’ ħmira u ċċentrifuga biex tneħħi s-supernatant. Jekk meħtieġ, iċ-ċelloli jistgħu jinħaslu darba b'PBS, jassorbu l-likwidu residwu sewwa fl-aħħar darba. Vortex bil-mod biex ixerred iċ-ċelloli kemm jista 'jkun.

b) Żid 100-200 μL ta' IP lysate li fih inibitur tal-protease u daqqa bil-mod biex tferrex kompletament il-batterja jew il-fungi.

c) Banju tas-silġ għal 10 min, għal liżi aħjar, batterji u ħmira jistgħu jiġu diġeriti b'lisożima u enzima li tkisser il-ħajt (provduta minnha nfisha) rispettivament, u mbagħad lisati b'IP lysate li fih inibituri tal-protease.

d) Iċċentrifuga fi 12,000 xg għal 5 minuti f'4 gradi, armi l-preċipitat u aspira s-supernatant għal esperimenti sussegwenti ta' immunopreċipitazzjoni jew immunopreċipitazzjoni.

3. Preparazzjoni ta 'żibeġ manjetiċi

a) Erġa’ ssospendi bil-mod iż-żibeġ manjetiċi ta’ SweMagrose Protein A/G biex tifforma dispersjoni ta’ żibeġ omoġenja kemm jista’ jkun, żid 20 ul ta’ dispersjoni ta’ żibeġ imħallta sew għal kull 500 ul ta’ kampjun, ħu ammont xieraq ta’ żibeġ manjetiku żibeġ f’tubu EP nadif u żid 1x TBS għal volum finali ta’ 0.5 mL (20 ul ta’ dispersjoni ta’ żibeġ għal kull kampjun jintuża fil-passi ta’ immunopreċipitazzjoni li ġejjin bħala eżempju).

b) Erġa’ ssospendi bil-mod iż-żibeġ manjetiċi, poġġi fuq stand ta’ separazzjoni manjetika għal 30 s, neħħi bir-reqqa s-supernatant u rrepeti l-passi ta’ hawn fuq darbtejn.

c) Iż-żibeġ manjetiċi ġew sospiżi mill-ġdid b'1x TBS skont il-volum tad-dispersjoni inizjali taż-żibeġ.

4. Antikorp li jorbot ma 'żibeġ manjetiċi ta' SweMagrose Protein A/G

a) Preparazzjoni tal-antikorpi: iddilwa l-antikorp b'1x TBS biex tipprepara s-soluzzjoni tax-xogħol tal-antikorpi skont il-proporzjon tat-trattib rakkomandat fl-istruzzjonijiet tal-antikorpi, jew ipprepara l-antikorp f'soluzzjoni li taħdem għall-antikorpi b'konċentrazzjoni finali ta' 5-50 ug/mL , li jistgħu jiġu ppreparati fuq is-silġ;fakultattiv:uża IgG normali ta' l-istess speċi ta' antikorpi biex tħejji soluzzjoni normali ta' ħidma ta' IgG bl-istess proporzjon ta' dilwizzjoni jew konċentrazzjoni finali ta' 5-50 ug/mL, neħħi t-twaħħil mhux speċifiku jew isservi bħala kontroll negattiv. L-IgG normali tal-istess speċi tfisser li jekk l-antikorp użat fl-immunopreċipitazzjoni sussegwenti huwa IgG tal-ġrieden, ammont xieraq ta 'IgG normali tal-ġrieden jista' jiġi dilwit b'1x TBS f'dan il-pass biex jitnaqqas l-isfond jew bħala kontroll negattiv.

b) Assorbiment ta' l-antikorpi: Separa ż-żibeġ manjetiċi ta' SweMagrose Protein A/G ippreparati fil-pass 3 b'mod manjetiku, aspira s-supernatant, żid 500 μL ta' soluzzjoni ta' ħidma ta' antikorpi jew soluzzjoni normali ta' ħidma ta' IgG, erġa' ssospendi u mbagħad inkuba għal 15-60 min f' temperatura tal-kamra fuq turnover mixer.

Nota: Huwa wkoll possibbli li jiġu inkubati ż-żibeġ manjetiċi SweMagrose Protein A/G ippreparati fil-pass 3 direttament b'ammont xieraq ta 'antikorp jew IgG normali.

c) Separazzjoni manjetika u ħasil: Issepara ż-żibeġ inkubati b'mod manjetiku, aspira s-supernatant, żid 500 μL ta' 1×TBS, erġa' ssospendi ż-żibeġ SweMagrose Protein A/G billi nfiħ bil-mod b'pipetta, poġġi fuq xtilliera ta' separazzjoni manjetika għal 10 s. , neħħi s-supernatant, irrepeti l-ħasil għal tliet darbiet, u erġa' ssospendi ż-żibeġ bi 1 × TBS fl-istess ammont bħall-volum inizjali.

Nota: Jekk iż-żibeġ huma agglomerati jew jitfarfar waqt l-inkubazzjoni u l-ħasil, huwa fenomenu normali u mhux se jaffettwa r-riżultati sperimentali.

5. Immunopreċipitazzjoni (IP):

a) Tneħħija ta 'rbit mhux speċifiku (mhux obbligatorju): iż-żibeġ SweMagrose Protein A/G ippreparati fil-pass 4, li jorbtu IgG normali, huma inkubati mal-kampjuni f'4 gradi għal 60 min u separati b'ġbid manjetiku, u s-supernatanti huma użat għall-esperimenti sussegwenti; l-iskop ta 'dan il-pass huwa li jitneħħew il-proteini li jorbtu mhux speċifikament ma' IgG normali.

b) Inkubazzjoni ta’ kampjuni bi żibeġ ta’ SweMagrose Protein A/G konjugati ma’ antikorp jew IgG normali: żid SweMagrose Protein A/G żibeġ konjugati ma’ antikorp jew IgG normali fil-proporzjon ta’ 20 ul ta’ sospensjoni ta’ żibeġ għal kull 500 ul ta’ kampjun ta’ proteina, poġġi fuq shaker li joxxilla l-ġenb jew mixer li jdur, u inkuba għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra jew matul il-lejl fi 4ºC.

Nota 1: Jekk iż-żibeġ huma agglomerati jew saffi waqt l-inkubazzjoni u l-ħasil, huwa fenomenu normali u mhux se jaffettwa r-riżultati sperimentali.

Nota 2: Alternattivament, l-ammont xieraq ta 'antikorp jew IgG normali jista' jiġi inkubat mal-kampjun għal 1-2 sigħat f'temperatura tal-kamra jew matul il-lejl f'4 gradi , u mbagħad 10-20 μL ta' sospensjoni ta 'żibeġ manjetiċi jistgħu jiġu miżjuda u inkubati għal 60 minuta f'temperatura tal-kamra.

c) Separazzjoni manjetika: wara l-inkubazzjoni, poġġi fuq stand ta 'separazzjoni manjetika għal 10 sekondi biex tneħħi s-supernatant.

Nota:Żomm porzjon tas-supernatant biex tittestja l-effett tal-immunopreċipitazzjoni.

d) Aħsel: Żid 500 ul ta' 1×TBS, daqqa bil-mod iż-żibeġ sospiżi mill-ġdid b'pipetta, poġġi fuq separatur manjetiku għal 10 sekondi biex tneħħi s-supernatant u rrepeti l-ħasla tliet darbiet.

Nota: Tista 'wkoll tittestja l-OD280 tas-soluzzjoni tal-ħasil biex tiddetermina jekk il-ħasil huwiex komplut, jekk l-OD280 huwa aktar minn 0.05, in-numru ta' ħinijiet tal-ħasil għandu jiżdied b'mod xieraq.

6. Elużjoni

Skont il-karatteristiċi tal-proteina fil-mira u r-rekwiżiti ta 'esperimenti sussegwenti, wieħed mill-metodi li ġejjin jista' jintgħażel għall-elużjoni.

a) Metodu ta' elużjoni ta' denaturazzjoni:Kampjuni elużi b'dan il-metodu huma adattati għal SDS-PAGE. Neħħi t-tubu EP mis-separatur manjetiku, żid 25 µL ta’ 1× Protein Sampling Buffer (Mnaqqsa) mat-tubu, saħħan f’95 grad għal 5 min, u mbagħad wettaq separazzjoni manjetika biex tiġbor is-supernatant għall-iskoperta tal-Western blot.

b) Elużjoni bl-aċidu:Il-kampjun eluwit b'dan il-metodu jżomm l-attività bijoloġika oriġinali tiegħu u jista' jintuża għal analiżi post-funzjonali. Neħħi t-tubu EP mir-rack tas-separazzjoni manjetika, żid 20 µL ta’ Acid Elution Buffer mat-tubu, ħawwad sew u inkuba f’temperatura tal-kamra għal 10 minuti, imbagħad wettaq separazzjoni ta’ ġbid manjetiku, iġbor is-supernatant f’tubu EP ġdid, u immedjatament żid 2 µL ta' Neulization Elution Buffer biex taġġusta l-pH tal-prodott eluż għal newtrali, li jista' jintuża għal analiżi post-funzjonali.

Nota: L-utent jista 'jaġġusta l-ammont ta' buffer ta 'eluzzjoni miżjud skond il-volum mixtieq.

1. Taħżinx SweMagrose Protein A/G fil-kit fi grad -20 jew tiffriża u tinħall ripetutament, inkella taffettwa l-prestazzjoni ta 'żibeġ manjetiċi u tikkawża żbalji sperimentali bla bżonn.

2. Jekk jogħġbok aqra dawn l-istruzzjonijiet bir-reqqa qabel ma twettaq il-proċedura ta 'immunopreċipitazzjoni.

3. Il-qafas ta 'separazzjoni manjetika għas-separazzjoni manjetika jeħtieġ li jiġi pprovdut minnu nnifsu

4. Jekk il-proteina fil-mira immunopreċipitata tinvolvi modifika ta 'fosforilazzjoni jew aċetilazzjoni, għandhom jiġu pprovduti inibituri xierqa ta' phosphatase u deacetylase.

5. Żomm żibeġ f'pH 6-8, evita ċentrifugazzjoni b'veloċità għolja, tnixxif jew iffriżar; tesponix żibeġ għal kampi manjetiċi għal perjodi twal ta 'żmien li jistgħu jikkawżaw agglomerazzjoni taż-żibeġ.

6. Iż-żibeġ għandhom jitħalltu sewwa qabel l-użu, l-operazzjoni tat-taħlit għandha tkun ġentili u m'għandhiex tkun soġġetta għal dawwar u tħawwad vjolenti biex tiġi evitata d-denaturazzjoni tal-antikorp.

7. Kontrolli pożittivi u negattivi (SweMagrose Mouse IgG) huma rakkomandati fl-immunopreċipitazzjoni.

8. Il-kampjuni tal-proteini għandhom jiġu ppurifikati kemm jista 'jkun malajr wara l-ġbir u dejjem jitqiegħdu f'4 gradi jew f'banju tas-silġ biex inaqqsu d-degradazzjoni jew id-denaturazzjoni tal-proteini.

9. Żibeġ manjetiċi jistgħu jinġabru meta jintużaw b'eluzzjoni ta 'aċidu, li huwa fenomenu normali u ma jaffettwax l-użu normali ta' żibeġ manjetiċi.

10. Għall-użu tar-riċerka biss. Mhux għall-użu fi proċeduri dijanjostiċi jew terapewtiċi.

11. Ilbes ilbies protettiv adattat bħal overolls tal-laboratorju, nuċċalijiet tas-sigurtà u ingwanti.

12. Il-kapaċità ta' rbit tal-Proteina A u l-Proteina G ma' antikorpi ta' sorsi u sottotipi ġeneriċi differenti tidher fit-Tabella I.

Tabella 1

Għall-użu tar-riċerka biss. Mhux għall-użu fi proċeduri dijanjostiċi jew terapewtiċi!

It-tags Popolari: kit ta 'immunopreċipitazzjoni (żibeġ manjetiċi ta' proteina a/g), manifatturi ta 'kitt ta' immunopreċipitazzjoni taċ-Ċina (żibeġ manjetiċi ta 'proteina a/g), fornituri, fabbrika